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Resource typeDissertation
Title(s)Mechanismen eines veränderten Wachstumsverhaltens von Lungenfibroblasten bei Patienten mit Emphysem – Hinweise auf einen seneszenten Phänotyp
Alternative title(s)Mechanisms of an altered proliferation in lung fibroblasts from patients with emphysema - Markers of a senescent phenotype
CreatorMüller, Kai-Christian
AdvisorRuck, Wolfgang K. L.  0000-0002-5715-0507  1051421330
AbstractOne of the major factors contributing to the development of environmentally induced diseases in human subjects is exposure to inhaled toxic compounds of varying origin, in particular oxidants. In addition to work-related and environmental exposures to gases and particles, inhalation of tobacco smoke, either actively or by passive smoking, belongs to these detrimental conditions. In fact, tobacco smoke represents the major indoor air pollutant. Active smoking, and to a lesser extent passive exposure, can lead to the development of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). While the exposure is indispensible for eliciting the disease, additional environmental, behavioural and genetic factors beyond those affecting directly the lung also seem to be involved in the development of COPD. Among the pathophysiological and clinical phenotypes of COPD, a major form is given by lung emphysema. This is characterised by a large-scale destruction of the peripheral lung, in particular the alveolar structures, leading to a loss of elastic recoil of the lung and a reduction of surface that impedes the exchange of respiratory gases. Fibroblasts represent a major structurally important cell type in the body, and they also play a fundamental role in the structural maintenance of the lung. The work presented here focuses on environmentally induced changes in the behaviour of this cell type. It was based on the observations that (1) smokers may not only develop lung emphysema but (2) also show signs of premature ageing, that (3) oxidative agents are capable of inducing a senescent cellular phenotype in culture, that (4) aged cells show a lower rate of cell proliferation and respond less to mitgenic stimuli than young cells, and that (5) the clinical course of emphysema does not appear to be fully accounted for by acute airway inflammation. Based on this it was hypothesized that in lung emphysema parenchymal fibroblasts, i.e. fibroblasts from the alveolar region, show signs of premature ageing or cellular senescence compared to cells from smokers who did not develop emphysema. Such a change in phenotype could result in impaired maintenance and regeneration of the lung and thereby lead to a progressive loss of lung structure over time. Thus the present work aimed at answering the questions (1) whether the proliferation of lung fibroblasts from patients with emphysema differs from that of control cells under standardised culture conditions, (2) whether lung fibroblasts show signs of senescence in emphysema, and (3) whether genes can be identified that are relevant for cellular senescence and show a persistent differential expression between cells from patients with empyhsema and those from control smokers. For this purpose sub-pleural, parenchymal fibroblasts were obtained from explants taken from resected lungs of patients with and without emphysema. Cells cultures were characterized for different markers and it turned out that cells of passage 2 after primary culture consisted almost entirely of fibroblasts. As a next step the rate of cell divisions during the exponential growth phase was determined. Fibroblasts from patients with emphysema showed a significantly reduced proliferation rate, or increased doubling time, compared to control cells. As this was observed 5–6 weeks after explantation of tissue, the finding indicates that fibroblasts from patients with emphysema behave intrinsically different from control cells even if no inflammatory environment is present. It is known that with increasing age cells not only show a reduced proliferation rate, but also a lower proliferative capacity, i.e. maximum number of divisions that can be achieved in vitro. Thus long-term culture of cells was performed to elucidate, whether the slower proliferation in emphysema was associated with a lower proliferative capacity, or whether fibroblasts, given sufficient time, would reach the same maximum number of divisions as the control cells. The differences regarding the initial slope of cell number curves paralleled the differences observed in the short-term proliferation experiments. The median number of maximum population doublings until stagnation of growth in serial passage was about 6 population doublings lower in cells from patients with emphysema; however, due to the large variability within groups statistical significance was not achieved with the sample sizes included. The analysis of the curvature of proliferation curves also yielded a difference of about 6 doubling. These findings were in support of the hypothesis that the reduced proliferation of lung fibroblasts from patients with emphysema reflected persistent, intrinsic alterations similar to cellular senescence. As a further phenomenological marker of cellular ageing, the expression of the senescence- associated beta-galactosidase was quantified. Cells from patients with emphysema showed a significantly elevated activity of this enzyme, indicating a higher degree of cellular senescence. The validity of the assay was confirmed by staining of serial passages. The most important mechanism underlying chronological cellular ageing is the shortening of telomeres. Telomeres are short DNA repeats located at the ends of chromosomes acting as downward counters of the remaining cell division capacity. Thus a comparison of telomere length between groups was performed, using a standard immunological technique. Telomere length was not significantly different between groups, and the probability that telomeres were shorter in emphysema despite the observed result was estimated to be less than 5 %. According to this result, the reduced proliferation rate of fibroblasts from patients with emphysema appeared to be mediated by telomere-independent mechanisms. This is important information, as it suggests a stress-induced senescence to be more likely than a purely chronological senescence. Persistent alterations of cellular behaviour, either stress-induced or not, are associated with alterations in gene expression. To elucidate the molecular mechanisms underlying the observed behaviour in cell culture, the expression (mRNA) of a large number of genes distributed throughout the genome was explored using two cDNA arrays (gene chips) that comprised approx. 12.000 genes. The expression of selected genes that had been identified by the array as of potential relevance was checked by quantitative real-time PCR (qPCR) in samples that were obtained independently from those used in the cDNA array. The exploratory cDNA array analysis was performed using combined (pooled) mRNA samples from 3 patients with emphysema and 3 patients without emphysema. Overall, the result suggested a higher number of genes to be down- than up-regulated in emphysema compared to control. For the senescence-associated genes IGFBP-3 and IGFBP-rP1 the differences in gene expression between groups as detected in the arrays were confirmed by qPCR. Both of these proteins were significantly up-regulated in emphysema. The respective mRNAs code for proteins that control the effects of insulin and insulin-like growth factors on cell metabolism and proliferation. The method of qPCR was additionally applied to a panel of other genes that were found to be differentially expressed on the cDNA arrays and that are known to be associated with cellular senescence. The panel comprised FOSL1, LOXL2, OAZ1, CDK4, IGFBP-5, -rP2 (CTGF) and -rP4 (Cyr61). According to qPCR the expression of these genes was not different between groups. Different gene expression does not neccessarily lead to differences in protein synthesis. Therefore, the amount of IGFBP-3 protein was determined in addition to mRNA analysis. In accordance with gene expression results, the level of IGFBP-3 was found to be elevated in cell culture supernatants of lung fibroblasts from patients with emphysema. In conclusion, the data of this study demonstrated that parenchymal lung fibroblasts from patients with emphysema showed a reduced proliferation rate and capacity in vitro compared to cells from smokers without emphysema. Taken together with the results of staining for a marker of cellular senescence the data support the hypothesis of a senescent phenotype of lung structural cells in emphysema. The findings that alterations persisted in cell culture on one hand and that there was no difference in telomere length on the other hand, renders a stress-induced cellular senescence the most likely explanation. It is probable that this phenomenon is mediated by epigenetic mechanisms that are part of the disease. Furthermore, the up-regulation of anti-proliferative binding proteins of the insulin axis in emphysema, as shown by two independent methods of gene expression analysis, suggests a link between the local behaviour of structural cells and systemic factors for which insulin and insulin-like growth factors are paradigmatic. These findings bear the potential to promote the understanding of the pathogenesis of lung emphysema, by taking a novel point of view on the chronicity of the disease. As the data describe the result of a long-term exposure to a common noxious agent, it is not unreasonable to expect that they could be helpful also for a deeper understanding of other environmentally and/or behaviourally induced diseases.

Die wiederholte Exposition des Menschen gegenüber inhalierten oxidativen Noxen unterschiedlicher Genese ist ein wesentlicher Faktor bei der Entstehung umweltinduzierter Erkankungen. Zu diesen Noxen gehört neben arbeitsplatzbezogenen Noxen in Form aggressiver Gase und Partikel insbesondere der inhalative Zigarettenrauch (aktiv wie passiv) als Hauptschadstoffbelastung im Innenraumbereich. Das aktive Rauchen, und in geringerem Maße das Passivrauchen, können die Entstehung einer chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) bewirken. Über die genannten Noxen hinaus kann die Entwicklung der Erkrankung durch andere Umwelt- und Verhaltensfaktoren begünstigt werden. Eine pathophysiologisch bedeutsame Komponente der COPD ist das Lungenemphysem. Es ist durch eine Zerstörung der alveolären Strukturen gekennzeichnet, die sich im Verlust der elastischen Spannung der Lunge und ihrer Gasaustauschfähigkeit widerspiegelt. Da Fibroblasten eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der Struktur der Lunge spielen, fokussierte die vorliegende Arbeit auf umweltinduzierte Veränderungen im Verhalten dieses Zelltyps. Sie ging von der Beobachtung aus, dass Raucher häufig Zeichen einer vorgezogenen Alterung aufweisen, dass oxidative Noxen Zellen in Kultur in einen gealterten Zustand versetzen können, dass gealterte Zellen eine geringere Bereitschaft zur Zellteilung zeigen und dass die Erkrankung Zeichen eines autonomen Progresses aufweist, der nicht alleine durch akute Entzündung erklärt werden kann. Daraus ergab sich die Hypothese, dass parenchymale, d.h. dem alveolären Bereich entstammende Fibroblasten der Lunge Zeichen einer vorgezogenen Alterung (Seneszenz) im Vergleich zu den Zellen von Rauchern ohne Lungenemphysem aufweisen. Derartige Änderungen hätten die Störung der Regeneration der Lunge und somit einen Gewebeabbau im Verlauf der Jahre zur Folge. Im Rahmen dieser Arbeit sollte somit geklärt werden, (1) ob und wie sich das Wachstum der Fibroblasten beim Lungenemphysem von demjenigen der Kontrollzellen unterscheidet, (2) ob der Phänotyp der Fibroblasten von Patienten mit Emphysem Zeichen einer vorzeitigen Alterung aufweist, (3) welche für eine zelluläre Seneszenz möglicherweise relevanten Gene unter den standardisierten Bedingungen der Kultur eine dauerhaft veränderte Expression aufweisen. Auf dieser Basis wurden Lungenfibroblasten aus Operationsresektaten von Patienten mit und ohne Emphysem untersucht. Die Charakterisierung der aus Explantaten gewonnenen Kulturen umfasste zunächst eine Reinheitsbestimmung der Zellkulturen. Hierbei ergab sich, dass in der zweiten Passage nach Primärkultur die Fibroblasten nahezu in Reinkultur vorlagen. Sodann wurde die Zellteilungsrate der Fibroblastenkulturen in beiden Gruppen während der exponentiellen Wachstumsphase quantifiziert. Es wurde eine signifikant verminderte Verdopplungsrate der Fibroblasten von Patienten mit Emphysem beobachtet. Da die Zellen im Abstand von 5-6 Wochen von der Entnahme untersucht wurden, ließ sich schließen, dass die Fibroblasten der Patienten mit Emphysem intrinsisch verändert waren und nicht akuter inflammatorischer Reize bedurften, um sich anders als die Kontrollzellen zu verhalten. Gealterte Zellen unterscheiden sich von nicht gealterten Zellen nicht nur durch eine geringere Teilungsrate, sondern auch durch eine geringere maximale Zahl von Teilungen. 2 Daher wurde in Langzeitkulturen untersucht, ob die langsamere Proliferation beim Emphysem mit einer geringeren proliferativen Kapazität einhergeht bzw. ob die Fibroblasten bei genügend großer zur Verfügung stehender Zeit die gleiche maximale Zahl von Teilungen erreichen, wie die Kontrollzellen. Die Unterschiede der initialen Steigung der Zellteilungskurven waren gleichsinnig zu den in den Kurzzeitversuchen beobachteten Unterschieden. Der Median der maximalen Zahl der Populationsverdopplungen bis zur Stagnation des Wachstums in serieller Passage lag bei den Zellen der Patienten mit Emphysem um ca. 6 Verdopplungen niedriger, wenn auch wegen der großen Streuung innerhalb der Gruppen der Unterschied nicht statistisch signifikant war. Die Analyse der initialen Form der Kurven ergab ebenfalls eine Verschiebung um 6 Verdopplungen bei den Zellen der Patienten mit Emphysem. Dieser Befund bestätigte die Annahme, dass die verminderte Proliferationsrate der Lungenfibroblasten von Patienten mit Emphysem persistierende, intrinsische Änderungen widerspiegelte. Als phänomenologischer Indikator der Zellalterung wurde im nächsten Schritt die Expression der Seneszenz-assoziierten beta-Galaktosidase untersucht. In der Tat fand sich in den Zellen der Patienten mit Lungenemphysem eine signifikant stärkere Aktivität dieses Enzyms, im Sinne einer zellulären Seneszenz. Die Validität dieses Nachweises konnte mittels serieller Anfärbungen bestätigt werden. Einer chronologischen zellulären Alterung liegt i.a. als zentraler Mechanismus die Verkürzung der am Ende der Chromosomen befindlichen Telomeren zugrunde, die als Abwärtszähler der verbleibenden Zellteilungskapazität fungieren. Daher wurden mit Hilfe einer immunologischen Technik die Telomerenlängen vergleichend untersucht. Die Telomerenlängen waren nicht zwischen den Gruppen verschieden und die Wahrscheinlichkeit eines dennoch bestehenden Unterschiedes konnte auf einen Wert von weniger als 5 % berechnet werden. Daher scheint die beobachtete reduzierte Proliferationsrate auf Telomeren-unabhängigen Mechanismen zu beruhen; dies spricht stärker für den Typ einer durch Noxen induzierten als einer chronologischen Seneszenz. Um einen Überblick über die Mechanismen zu gewinnen, die eine derartige Form der Seneszenz charakterisieren, wurde mit Hilfe eines 12.000 Gene umfassenden cDNA-Arrays (Genchip) die Expression (mRNA) einer für das Genom repräsentativen Menge von Genen in Zellkultur exploriert. Eine Auswahl der auf diese Weise qualitativ identifizierten Gene wurde dann in unabhängig angezogenen Zellkulturen mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) auf ihre Expression hin überprüft. Der explorative cDNA-Array wurde mit zusammengefassten Proben jeweils dreier Fibroblastenkulturen von Patienten mit und ohne Emphysem durchgeführt; er zeigte summarisch eine größere Zahl ab- als aufregulierter Gene beim Emphysem. Die im Array beobachteten Unterschiede der Genexpression zwischen den Gruppen konnten in der qPCRUntersuchung für die bekanntermaßen Seneszenz-assoziierten Gene IGFBP-3 und IGFBPrP1 bestätigt werden, die beim Emphysem signifikant aufreguliert vorlagen. Beide Gene codieren für Proteine, die die Effekte von Insulin und Insulin-artigen Faktoren steuern. Eine unterschiedliche Expression anderer Gene, die nach Literaturbefunden mit zellulärer Seneszenz assoziiert sind und im Array in der Regel unterschiedlich ausgeprägt gefunden wurden, ließ sich in der qPCR nicht bestätigen; dies betraf FOSL1, LOXL2, OAZ1, CDK4, IGFBP-5, - rP2 (CTGF) und -rP4 (Cyr61). Da eine unterschiedliche Genexpression nicht notwendigerweise eine unterschiedliche Proteinsynthese nach sich zieht, wurde zusätzlich die Proteinmenge von IGFBP-3 im Überstand der Zellkulturen analysiert. In Übereinstimmung mit den Expressionsbefunden fand sich IGFBP-3 vermehrt bei Fibroblasten, die von Patienten mit Emphysem stammten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass parenchymale Lungenfibroblasten von Patienten mit Lungenemphysem eine verminderte Proliferationsrate und -kapazität besitzen. In Verbindung mit den Daten der Anfärbung für einen zellulären Seneszenzmarker spricht dies für das Vorliegen eines seneszenten zellulären Phänotyps beim Emphysem. Die Tatsache, dass einerseits die Änderungen in Kultur persistierten und dass andererseits kein Unterschied der Telomerenlängen bestand, legt eine durch epigenetische Mechanismen vermittelte induzierte Seneszenz der Zellen nahe. Die mittels gestaffelter Analyse der Genexpression gefundene Aufregulation von anti-proliferativen Proteinen der Insulinachse wie IGFBP-3 und IGFBP-rP1 in Lungenfibroblasten von Patienten mit Emphysem erlaubt es darüber hinaus, eine Verbindung zwischen dem lokalen Verhalten von Strukturzellen und systemischen, über Insulin und insulinartige Wachstumsfaktoren vermittelten Änderungen zu schlagen. Diese Daten sind neuartig und erscheinen hilfreich für das Verständnis der Pathogenese des Lungenemphysems. Da sie modellhaft das Ergebnis einer chronischen Belastung mit einer Noxe auf Zellen widerspiegeln, ist anzunehmen, dass der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz und die diesen Ansatz bestätigenden Daten auch für das Verständnis anderer, durch Umwelt und/oder Verhalten induzierter Erkrankungen förderlich sind.
KeywordsEmphysema; Smoking; Fibroblasts; Lung; Geneexpression; Emphysem; Tabakrauch; Zigarettenrauch; Rauchen; Alterung; Fibroblast; Lunge; Schadstoff; Genexpression
Date of defense2006-02-13
Year of publication in PubData2006
Publishing typeFirst publication
Date issued2006-03-16
Creation contextResearch
Granting InstitutionLeuphana Universität Lüneburg
Published byMedien- und Informationszentrum, Leuphana Universität Lüneburg
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